RT-PCR試劑盒樣品制備操作步驟

　　RT-PCR試劑盒樣品制備：

　　本試劑盒是把RNA合成cDNA，然后再對此cDNA進(jìn)行擴(kuò)增的試劑盒。RNA的純度會影響cDNA的合成量，而制備RNA的關(guān)鍵是要抑制細(xì)胞中的RNA分解酶和防止所用器具及試劑中的RNA分解酶的污染。

　　因此，在實驗中需要采取以下措施：戴一次性干凈手套；使用RNA操作專用實驗臺；在操作過程中避免講話等等。通過以上辦法可以防止實驗者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

　　【使用器具】

　　盡量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，應(yīng)在使用前按下列方法進(jìn)行處理。

　　（1）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下處理12小時。

　　（2）然后在120℃下高壓滅菌30分鐘以除去殘留的DEPC。

　　RNA實驗用的器具和儀器建議專門使用，不要用于其它實驗。

　　【試劑配制】

　　用于RNA實驗的試劑，須使用干熱滅菌（180℃，60min.）或用上述方法進(jìn)行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（也可使用RNA實驗用的一次性塑料容器），使用的無菌水須用0.1%的DEPC處理后進(jìn)行高溫高壓滅菌。

　　RT-PCR試劑盒實驗用的試劑和無菌水都應(yīng)專用，避免混用后交叉污染。

　　【制備方法】

　　使用簡單的RNA純化方法即可獲得滿足于RTPCR反應(yīng)的RNA（只需少量的RNA便可進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)）。但為了保證實驗的成功率，建議使用GTC法（異硫氰酸肌法）制備的高純度RNA。

　　使用Catrim ox-14MRNA Isolation Kit Ver.2.11（TaKaRa CodeDWA005）可從血液中快速提取高純度的TotalRNA。

　　使用本試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)時，每次反應(yīng)所需的適量TotalRNA約為500ng。