RT-PCR試劑盒使用注意事項(xiàng)

　　RT-PCR試劑盒反應(yīng)就是從RNA反轉(zhuǎn)錄至cDNA，然后通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增cDNA的過程。試劑盒采用了一步反應(yīng)法完成整個(gè)RT-PCR反應(yīng)，即RNA-cDNA-PCR反應(yīng)操作在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)過程中不需增加額外的步驟，就可完成整個(gè)RT-PCR反應(yīng)，同時(shí)整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)且含有電泳時(shí)所需要的試劑，可直接上樣電泳。本試劑盒具有方便、簡捷、靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可適用于各種動(dòng)、植物、病毒RNA的PCR檢測。

　　RT-PCR試劑盒備注：

　　1.用戶可根據(jù)自己的情況調(diào)整優(yōu)化PCR反應(yīng)擴(kuò)增參數(shù)：

　　·退火溫度：可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)?shù)靥岣呋蚪档屯嘶饻囟龋?0℃~65℃）。

　　·延伸時(shí)間：延伸時(shí)間因目的序列長度的不同而不同

　　·循環(huán)次數(shù)：cDNA量較少時(shí)，循環(huán)次數(shù)可增加為40~50次

　　·調(diào)整鎂離子的濃度

　　2.用戶可根據(jù)本試劑盒提供的β-actin引物（陽性對照）驗(yàn)證RT-PCR體系是否良好（選做）：

　　1.使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s；

　　2.取滅過菌且無核酸酶的0.2mlPCR管，依次加入。

　　RT-PCR試劑盒使用注意事項(xiàng)：

　　1.平臺效應(yīng)：PCR不能進(jìn)入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定。

　　2.防止DNA的污染：①采用DNA酶處理RNA樣品；②在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。

　　3.RNA提取試劑盒：目前試劑公司有多種RNA提取試劑盒、cDNA試劑盒、PCR試劑盒以及RT-PCR試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。如果使用試劑盒，具體操作步驟請參照試劑盒說明書。